Нобелевские лауреаты по химии 2002

Noskov Sergey · Post by **Noskov Sergey** » 04 May 2003 18:38

2002 John B. Fenn, Koichi Tanaka, Kurt W&thrich
За что? За разработку физико-химических методов анализа макро-молекул ( масс-спектрометрия(John B. Fenn Koichi Tanaka ), ядерный магнитный резонанс). С 1-м знаком так себе, а вот со вторым...

Поэтому поговорим о Курте Вютрихе i ЯМР. Он-швейцарец, начальник лабораторий молекулярной биологии в Цюрихе и Ла-Холе, Калифорния. Чем ЯМР хорош? Позволяет решить 3-х мерную структуру белка в растворе, сейчас в принципе доскакал до разрешений криталлографов и можно сказать идеален для решения небольших протеинов до 30 кДа. Вютрих занимается разнообразными белками от феромонов до сигнальных протеинов , дефекты в которых приводят к глобальным заболеваниям. Завтра напишу поподробней.

ЯМР в последние 2 года подложил большую свинью на пару с рассеянием нейтронов в современную структурную биологию. Т.е. об этом подозревали и раньше , но говорить не хотели... Решив структуры на высоком уровне разрешения, выяснилось , что проклятые белки вовсе не так "статичны", а средняя структура образуется примерно 1000-5000 возможных конформаций всех аминокислот, причем многие из них близки к крайне неудобным в плане енергетики, и вовсе не факт , что те средние структуры которые столь популярны в журналах Натура и Наука являются фунцкионально активными. Т.е. микродинамика ,господа, можне играть большую и поганую роль в функциональной активности протеинов. Значит ли это , что все картинки перечеркнуты, вовсе нет, т.е. надо рисовать дальше...

GoodBuyAmerica · Post by **GoodBuyAmerica** » 07 May 2003 07:18

Позвольте задать пару практических вопросов. Какое нужно поле спектрометра для решения 3D структуры белка в 30 KDa? Нужно ли метить все атомы 2H, 15N, и 13C? Если ответы выходят за рамки форума, подкиньте, пожалуйста, ссылочку. Спасибо.

Noskov Sergey · Post by **Noskov Sergey** » 07 May 2003 16:52

По моему это вполне в духе топика. Итак продоложим(в продолжении будут ответы на Ваши вопросы). В 1969-1971 было показано, что ЯМР спектр глобулярного протеина и его развалившаяса цепочка довольно суцественно отличаются. Поля тогда были слабенькиe (Вютрих называл цифри в 100-200 МГц, сецйхас нормально иметь 600-100 0MHz), Фурье трансформа ешe не было, он придет несколькими годами позднее с работами Ричарда Ернста.
Четкой стратегии использования меток тоже не существовало, первой молекулой на которой стали работать был один из хемо-протеинов, большой кстати. Но уже было известно про ядерный эффект Овенхаузера(NOE), т.е. взаимодействие между ядрами пропорчионально дистанции между ними в 6-степени (похоже на Леннард-Джонсовский потенциал чем-то). Диагональ подобного спектра( он был 2-Д вначале) соответсвует 1-Д спектру химических сдвигов, поскольку магнетизация передается от ядра к ядру. И вот тут Вютрих со-товарищи сделали открытие, что можно очень четко арактеризовать пары протонов на дистанции менее 5 А друг от друга. Сейчас общепринято исользовать метки на N15 и С13. Спектры получаются при наложение полей вдоль различных осей, и ЯМР стал одной из 2-х действительно опробованных техник для получения информации о пространственной структуре белка. Несмотря на все свои очевидны плюсы, минусов тоже хватает, как правило ты имеешь дело не с одной структурой а с серией структур, иногда сильно отличных из за природы наложенных НОЕ ограничений, часто растворы решаются в очень кислой среде и белок может быть не функциональным. По моему личному опыту(мы делаем много био-моделированию и причаствны к одному из основных программных продуктов в этой области CHARMM) структруы ЯМР очень нестабильны именно в плане термодинамики и воспроизведения микро-динамики протеина в МД моделировании например.
О перспективах и объектах напишу в слeдующем посте, а то руки устали.
Да и ЯМР это явно не мой конек, мне как то кристаллография ближе.

GoodBuyAmerica · Post by **GoodBuyAmerica** » 09 May 2003 06:44

1. А зачем метить 15N и 13C если меряют 1H-1H NOE? Как эти ядра используют?
2. Почему белок загоняют в кислый буффер? Чтобы подавить обмен протонами?
3. Таки какой белок можно мерять на, скажем, 600 MHz? 1 GHz - это, конечно, здорово, "да ктож ему дасть?"

Noskov Sergey · Post by **Noskov Sergey** » 09 May 2003 17:42

Давайте немного отделим мух от котлет. Для решения структур до 100 амино-кислотных остатков Вы можете спокойно жить лишь с Н меткой, используя всякие там хиторсти, типа поля с разными частотатми и в разных наборах, пульсы. После чего Вы ращитываете NOE restrains и оценочыe значен энергий группы возможных структур, работает это неплохо. Однако если у Вас протеин стал большим, тогда "Ой!".
Вам надо вводить дополнительные метки , как-то С или N для работы в N-измерениях(multi-dimensional NMR) ЯМР спектра, т.е. с увеличением количества меток растет количество измерений в ЯМР грубовато, но это так, или Вам нужна теория этого дела. Собственно, если протеин кристаллизуется то и маяться не надо, кристаллография явно лучше, там есть свои подлянки типа артефактов упаковок поверхностей, но они относительно небольшие по сравнению с ЯМР, а вот когда Вам нужна динамика, тут серьезной альтернативы пока нет, ну например пути фолдинга Вам почему-то интересен. Нащет буфферов причина именно та, что Вы назвали, но она решена уже лет 5 как, т.е. стали использовать хитрые буфферы, какие не спрашивайте, я не знаю.

Поле в 14.09 Тесла(600MHz) весьма неплохое, там зависимость от силы поля далеко не линейная, т.е. вы много выиграете при переходе с 400 на 600, но с 600 на 800 эффект уже гораздо скромнее. Я бы назвал цифру в 100-200 аминокислотных остатков как возможную для получения разумного качества структуры.

GoodBuyAmerica · Post by **GoodBuyAmerica** » 10 May 2003 03:56

Мой интерес вызван тем, что в нашей компании идёт гнилой базар о приобретении магнита 600 MHz именно для исследования динамики и структуры ферментов, которые не удаётся закристализовать. Я не думаю, что это случится, и если уж и случится, то, думаю, не скоро. Но на всякий случай хотелось бы узнать, что это за зверь и с чем его едят. По отношению к ЯМР я - advanced user. Так что кой-чего знаю, но глубоко. Так что я очень благодарен Вам за просветительскую работу.

Вопрос в догонку: меченные белки как делают? Скармливают expression hosts меченные аминокислоты?

Noskov Sergey · Post by **Noskov Sergey** » 10 May 2003 19:30

Рад, что Вы находите это полезным. Я сам никогда ни ЯМР ни кристаллографию не делал, теоретики мы

Т.е. разрабатыem более аккуратные функции энергий, фитирования параметров для описания множественных структур и многое другое от путей фолдинга до протеин-лиганд взаимодействий. Кстати, я - хим.физик-физ.химик ,а вы помнится в одном из форумов говорили о невозможности нахождения работ в данной специальности, поверьте Вы не правы. (оффтоп, я хотел написать тогда, но забыл)

Но именно в силу подобной специфики я много вожусь с экспериментаторами и немного разобрался и в метках. Т.е. продолжим: Несмотря на давно разработанные принципы метки для ЯМР все еше дискуссионная область. Стандартно делают так: Рекомбинантная экспрессия протеина из старого доброго E Coli в тяжелой воде, N-15 аммониевых солях или C-13 меченой глюкозе, было несколько раз показано, что это дает униформное распределение меток по протеину.

Я ,кстати, посмотрел данные по ЯМР, они называют оптимум в массе до 40КДа для ЯМР спектроскопии.

Т.е. с униформным распределением все довольно просто. Проблемы начинаются когда Вам надо сделать селективные метки, стандартно это делают с помощью ауксотрофного E Coli (аutotroph E Coli strain), оно поломано так, что не может производить аминокислоты интересные для метки, зато в питательной среде этих меченных аминокислот хоть пузом ешь. Проблема в том, что уровень экспрессии для данного мутанта крайне низок, и получить меченного протеина достаточно для анализа, бывает сложно.

Сейчас появились неплохие наметки на использования других методов, в основном без-клеточных, т.е. метки делаются собственно в экспрессированных протеинах, тут сильны Хофман Ла Роше (Hoffman La Rosche) и я много не знаю, использование альтернативных систем для роста протеинов и меток.

GoodBuyAmerica · Post by **GoodBuyAmerica** » 11 May 2003 23:27

Спасибо за информацию. Makes perfect sense to me.

Нет ли хорошей "популярной" книжки по этому предмету?

По поводу работы для физхимиков. Я тут было начал Вам отвечать, но скоро сообразил, что лучше это будет сделать в разделе "Карьера". Когда я соберусь закончить и запостить свой ответ, я дам в этой теме ссылку.

Noskov Sergey · Post by **Noskov Sergey** » 12 May 2003 01:40

There are plenty of them...I like this one:
Alan Ferscht Structure and mechanism in protein science: A guide to enzyme catalysis and protein folding.
W.H.Freeman and Company. New York, 1996 and references there.
NMR: "Protein NMR spectroscopy"
Cavanagh, Fairbrother, PalmerIII, Skelton, Academic Press 1996
J. N. S. Evans, Biomolecular NMR Spectroscopy, Oxford University Press, Oxford, 1995.

Часть ниже конечно для топика про карьеры.
А про работы конечно давайте, можете в приват если хотите, буду рад.
Т.е. я лично стоял год назад перед выбором остаться в академии: было аж 2 позиции в хороших местах, с перспективой получить факультетскую позицию, которая воплощается в жизнь или уйти насовсем в фирму, был оффер из Hoffman La Rosche at Basel Biocentrum Swiss (сейчас немного жалею). Y меня совсем нет знакомых , работающих в biotech/chemistry индустрии at USA, но из скудного личного опыта работа нашлась за 1 месяц (2002), а сейчас у нас и вовсе бум, я имею в виду структурную биологию и особенно всякий там драг-дизайн. Я работал одновременно на фирму (Hoffman La Rosche&Taiwan Genomics) и академию на Тайване, было скучновато из -за грубой приземленности запросов в био-техе, но зарплата конечно радовала и очень.
Ещe такой ньюанс, мои интересы ныне вряд ли можно назвать в чистом виде физической химией или химической физикой.